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前言
金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 及其腸毒素可經(jīng)由食品媒介引起腸胃炎，為
食物中毒的主要致病原之一[1, 2]。中國大陸國 家標準金黃色葡萄球菌檢驗公告方法[3]建議 使用血瓊脂平板（BAP，以TSA或Columbia agar為基礎培養(yǎng)基）作為分離培養(yǎng)基。另外， 臨床微生物檢驗室常用TSA所配制的BAP接 種臨床檢體[4]，以便初步識別不同溶血型式的分離菌。
此兩種檢驗室之所以使用BAP， 系因為可利用此菌在BAP的 溶血性( -hemolysis)作為生長菌落的識別[3, 4]，BAP上菌落 的 溶血性系因為其中的紅血球被能夠產(chǎn)生溶 血素(hemolysin)的S. aureus所分解而破裂， 造成溶血現(xiàn)象，因此，菌落周圍將呈現(xiàn)環(huán)狀
透明[4]。 由于BAP配制所使用的基礎培養(yǎng)基因應 用對象不同而異，并且同種類菌不同菌株在
含有不同基礎培養(yǎng)基BAP的溶血能力是否相 同，將是臨床檢驗室或食品廠品管室檢驗人 員極欲了解的問題，目前，用于配制BAP的 基礎培養(yǎng)基種類包括 Tryptic Soy Agar-II
(TSA-II)、Columbia
Agar、Brucella Agar以 及brain
heart infusion agar (BHIA)，配制后 倒平板前，再添加5~10%綿羊血。其中，含 TSA-II的BAP用于培養(yǎng)一般常見的細菌及酵 母菌，含Columbia Agar的BAP用于培養(yǎng)嗜 氧性與兼性厭氧菌以及絕對厭氧菌，含Brucella Agar之BAP用于分離厭氧菌，而BHIA 則常用于分離真菌[5]。 在檢驗室，不同鏈球菌常利用其生長菌 落在BAP呈現(xiàn)的溶血型做為菌種或不同血清 群的初步鑒定依據(jù)[6]，一般 溶血型B群鏈球 菌(Group B streptococci，GBS)在 BAP的生 長菌落具有溶血性，但占約3~5%的 溶血型 B 群鏈球菌卻無法在BAP呈現(xiàn)明顯溶血性[7, 8]，因此，需要含有溶血加強劑才能誘導不 溶血的 GBS 菌落產(chǎn)生
溶血，否則易導致其 漏檢[9]。由于臨床上S. aureus亦可能出現(xiàn)侏
儒變異株(dwarf variant)，其對營養(yǎng)需求較 高，在BAP上常形成微小的菌落，而且通常
不具 -溶血型[10, 11]。有鑒于此，本研究以添 加與不添加溶血加強液至含不同基礎培養(yǎng)基 (TSA-II、Columbia agar、Brucella agar 與 BHIA)之BAP探討是否會對S. aureus ATCC 25923與 ATCC 6538溶血能力產(chǎn)生影響。
材料與方法
菌株制備 本研究使用 S. aureus ATCC 25923與 ATCC 6538作為培養(yǎng)基生長效能測試的標準 菌株，菌株保存于-70℃，研究操作前，將上
述菌株移種至 BAP（啟新生物科技有限公 司，新北市），培養(yǎng)于35±1℃培養(yǎng)箱中18~24 小時，共接種兩次以活化菌株。之所以選擇 此兩種菌株做為研究對象，系因ATCC 25923 為臨床[4]以及中國大陸國標食品微生物學檢 驗：金黃色葡萄球菌檢驗建議的標準菌株[3]， 而 ATCC 6538則為美國藥典[12, 13]及中華藥 典[14, 15]之無菌試驗法及非無菌產(chǎn)品中之特定微生物檢驗法建議的標準菌株。S. aureus ATCC 25923菌落在BAP上的菌落顏色為白 色，形狀為圓形、凸起典型菌落，而 ATCC 6538菌落顏色則為黃色，亦呈圓形、凸起， 兩種菌株的菌落大小相近。
培養(yǎng)基 本研究使用的各種基礎培養(yǎng)基均添加5% 綿羊血而制成 BAP，基礎培養(yǎng)基包含：(i) TSA-II、TSA-II+（TSA與 TSA-II+分別代表 未添加及添加溶血加強液之BAP）；(ii) Columbia agar、Columbia agar+（Columbia agar、 Columbia agar+分別代表未添加及添加溶血 加強液之BAP）；(iii) Brucella agar、Brucella agar+ (Brucella
agar、Brucella agar+分別代 表未添加及添加溶血加強液之 BAP)；(iv) BHIA、BHIA+（BHIA與 BHIA+代表未添加 及添加溶血加強液之BAP），這些含有各種 基礎培養(yǎng)基的BAP均購自啟新生物科技有限 公司（新北市，臺灣）。
測試菌懸浮液的制備 首先將新鮮生長S. aureus兩種菌株的生 長菌落分別以接種環(huán)挑取，然后移種至5 mL Tryptic Soy Broth (TSB)中，懸浮液調整至相 當于McFarland
No. 0.5的標準濃度，并以分 光亮度機測量調整其optic density (O.D.)值至 0.08~0.1之間，此時菌數(shù)約為1.5×108 CFU/ mL，接著進行十倍序列稀釋5次至約103 CFU/ mL后，然后進行各種BAP的溶血試驗。
溶血性試驗 以微量吸管分別吸取兩種菌株的菌液0.1 mL 單獨地加至 TSA-II、TSA-II+、Columbia
agar、Columbia agar+、Brucella
agar、Brucella agar+、BHIA 與 BHIA+ 所配制的 BAP，再以 無菌玻棒均勻涂抹，操作二重復。將所有接
種的BAP倒置培養(yǎng)于35±1℃培養(yǎng)箱，24±2小時后觀察所有BAP上生長菌落大小、溶血圈
大小，并進行菌落計數(shù)，然后比較未添加與 添加溶血加強液對兩菌株生長菌落溶血圈大 小的影響。以游標尺測量5 個單一菌落溶血
圈大小(cm)后加以平均，且計算標準偏差。本 研究以TSA-II血平板溶血圈大小作為對照組 (100%)比較兩種菌株在各種BAP的溶血能力。
結果
測試 S. aureus ATCC 25923與 ATCC
6538兩菌株在各個BAP (TSA-II、TSA-II+、 Columbia agar、Columbia agar+、Brucella agar、Brucella agar+、BHIA與 BHIA+)的菌 落數(shù)，選擇可計數(shù)的25~100 CFU 范圍，這 些BAP的平均菌落數(shù)落差都在30% 以內（圖 1），此指出兩菌株在各種 BAP 的生長效能 差別甚少[16]，且各個BAP上生長菌落的大小 相近，并不受基礎培養(yǎng)基的成分差異與溶血 加強液添加與否的影響，但溶血圈大小卻受 到菌株種類與基礎培養(yǎng)基成分的影響。 ATCC 25923 在含 TSA-II，TSA-II+， Brucellla agar與 Brucella agar+ 的 BAP與對 照組TSA-II溶血圈大小相近，而Columbia+ 的溶血圈雖然大于Columbia者，但與對照組 TSA-II比較，還是較小。另外，結果指出此
菌株在BHIA+上生長菌落的溶血能力最差， 此指出加入溶血加強液，反而會抑制此測試 菌株的溶血能力。（表1） ATCC 6538在含Columbia+與 Brucellla agar的 BAP與對照組含TSA-II的 BAP上生 長菌落的溶血圈大小無太大差異，然而，在 含 BHI與 BHI+者比含TSA-II的 BAP對照組 減少約25%，且溶血圈被抑制更為明顯，尤 其是添加溶血加強液者更為顯著。（表1）
討論
S. aureus因含有溶血素（ 、 、 、 毒 素）而可溶血紅血球，因此在BAP上的生長菌落具有完全( -)溶血性質，此特性可作為 初步鑒別此菌的依據(jù)之一[3, 4]，因此，BAP 上生長菌落所顯現(xiàn)的溶血性直接影響檢驗人 員的判讀，由于S. aureus為臨床感染及食品
中毒常見的病原菌之一，因此，更需要依據(jù) 溶血圈作為初步鑒別。臺灣衛(wèi)福部食藥署食 品金黃色葡萄球菌之檢驗，只建議使用BP培
養(yǎng)基(Baird-Parker medium)平板[17]，而中國
大陸國標方法則建議使用BAP 與 BP平板作 為初步分離食品檢體中的S. aureus[3]。 本研究計算BAP上生長菌落溶血圈大小 時，皆選擇菌落數(shù)25~100 CFU/平板的單一 菌落作為量測目標，此系為了避免生長菌落 過多，溶血圈互相干擾而影響其等的量測。 從 BAP 的基礎培養(yǎng)基成分分析， TSA-II、 Columbia agar、Brucella agar都含有胰消化 蛋白胨(pancreatic digest of casein)作為氮素 源，氯化鈉作為細菌生長環(huán)境酸堿變化的緩 沖劑，并維持滲透壓。其中，TSA-II額外添 加生長因子，Columbia agar添加牛浸心液與 玉米淀粉，而Brucella agar則含有亞硫酸氫 鈉[5]。S. aureus雖然可在含BHI成分的BAP 上生長，但其溶血能力不佳，研究結果發(fā)現(xiàn) 測試的兩種菌株在含BHIA與 BHIA+的 BAP 上溶血圈的大小都會下降，尤其是添加溶血 加強液者反而更會被抑制。另外，ATCC 6538 于添加溶血加強液之Columbia agar+ 上所出
現(xiàn)的溶血圈雖然比未添加者大些，但并不顯 著。 雖然S. aureus有些菌株生長菌落的外觀 屬于侏儒變異株(dwarf variants)，通常菌落 微小，不產(chǎn)生溶血[9, 10]，是否可藉由溶血加
強液的添加至BAP加以識別，值得未來加以 探討。 綜合上述，吾等認為(i) 含TSA-II、Columbia agar、Brucella agar基礎培養(yǎng)基的BAP 均可提供S. aureus生長菌落之明顯 -溶血性 而有助于其鑒別。(ii) 添加溶血加強液對 S.aureus 生長菌落之溶血圈大小與未添加者間
并無差異。(iii) 以 BHIA與 BHIA+基礎培養(yǎng) 基所配制的 BAP 不適用于 S. aureus 生長菌 落之鑒別，添加溶血加強液甚至會抑制此菌的溶血能力，因此，無論在食品或臨床檢驗 上，只需用以 TSA-II、Columbia agar、 Brucella agar基礎成分培養(yǎng)基配制的BAP進 行 S. aureus的分離及鑒別。
參考文獻
1. Le Loir Y, Baron F, Gauitar M. Staphylococcus aureus and food poisoning.
Genetics and Molecular Research 2003; 2.1:7-28. 2. 行政院衛(wèi)生福利部食品藥物管理署。金黃色葡萄球
菌 Staphylococcus aureus食品中毒。https://www.fda.
gov.tw/tc/siteContent.aspx?sid=1937。2010。 3. 中華人民共和國國家標準化管理委員會。食品安全 國家標準 食品微生物學檢驗：金黃色葡萄球菌檢驗。 GB 4789.10-2016。國家食品藥品監(jiān)督管理總局，中 華人民共和國。 4.
Becker K, Skov RL, Von Eief C. Staphylococcus, Micrococcus and other
catalase-positive cocci. In Jorgensen JH, Pfaller MA, Carroll KC, Funke G,
Landry ML, Richter SS, Warnock DW (eds). Manual of Clinical Microbiology. 11th
ed., 2015:44-53. ASM press, Washington DC, USA. 5. Becton, Dickinson and
Company (BD). DifcoTM and BBLTM Manual of Microbiological Culture Media. 2009:
90-2;103-4; 155-8; 567-8; 574-6. Sparks, Maryland, USA. 6. Sharma R, Gupta A.
Differentiation of oral streptococcal species by hemolysis in blood agar medium
in vitro. Microbiological reviews 1991; 3.4:733-51. 7. Verani JR, McGee L,
Schrag SJ. Prevention of perinatal
group B streptococcal disease revised
guidelines from CDC, 2010. MMWR Recomm Rep 2010; 59:1-32. 8. Chen TC, Wei CC,
Wang YJ et al. Improving GBS screening efficiency by modern tools application.
Poster PD-50. 2014 IFBLS & The 31st World Congress of Biomedical Laboratory
Science. Program book. 2014:79. 9. 蔡文城、葉卜碩、蔡偉勛、洪晟峯、王彥博、蔡岳 廷、呂旭峯。CMPTM ?/ GBS Detection Agar: 一種 偵測B群鏈球菌
溶血型菌株的創(chuàng)新培養(yǎng)基。檢驗及 品保雜志2015; 4:16-22。 10.
SlifkinML,MerkowP,KreuzbergerSAetal.Characterization of CO2-depentent
microcolony variants of Staphylococcus aureus. Am J Clin Pathol 1971;
56:584-92. 11. Sompolinsky D, Geller ZE, Segal J. Metabolic disorders in
thiamineless dwarf strains of Staphylococcus aureus. J Gen Microbiol 1967;
48:205-13. 12. U.S.PharmacopeiaNationalFormulary.<62>Microbiological
examination of nonsterile products: tests for specified microorganisms. USP 42.
2019:6393-402. USP. 13. U.S. Pharmacopeia National Formulary. < 71>Sterility
tests. USP 42. 2019:6407-14. USP. 14. 衛(wèi)生福利部。<7001>無菌檢查法。中華藥典，8th ed. 2016:289-95。臺灣。 15. 衛(wèi)生福利部。<7007.2>特定微生物檢驗法。中華藥 典，8th ed. 2016:300-6。臺灣。
16. U.S. Pharmacopeia National Formulary.
< 2021>Microbial enumeration tests: nutrition and dietary supplements.
USP 42. 2019:8509-14. USP. 17. 行政院衛(wèi)生福利部食品藥物管理署。食品微生物之檢驗方法-金黃色葡萄球菌之檢驗。2013 年 9 月 6 日 部授食字第1021950329號公告修正。衛(wèi)生福利部食
品藥物管理署，臺灣。
